本作首次将高达系列的舞台放到了名为“宇宙纪元”的世界中，在这个时空下，人类分为在地球土生土长的“自然人”以及被称为“调整者”的基因改造人类。故事剧情的主要矛盾冲突由自然人对调整者的能力的嫉妒和憎恶派生，进而产生仇恨，最终几乎所有调整者都移民到了外太空，在由他们自己设计名为P.L.A.N.T.的巨大轨道空间殖民地内，自号为“P.L.A.N.T.”并过着田园诗般的生活。但是地球和P.L.A.N.T.之间最终还是爆发了战争。
地球分为两个主要派系：“地球联合”由大多数自然人国家组成，主要是欧亚联邦和大西洋联邦，以及一个被称为“蓝色宇宙”的自然人至上主义团体，其口号是“为了保护我们的蓝色和纯净的世界”。“地球联合”不是一个统一的联盟，各民族国家之间存在着各种内斗和不信任；第二个主要的地球国家是欧普联合首长国，一个坚定的政治中立和孤立主义国家，位于由世袭君主制统治的小太平洋岛屿上，而且其公民中包含有部分调整者。
在故事开始前，发生了两件大事，其一是被称之为“血之情人节”的悲剧。事件中，隶属于P.L.A.N.T.的一个空间殖民地“尤尼乌斯7号”被地球联合的核弹摧毁；其二是P.L.A.N.T.发起了反击，将中子干扰器深埋在地壳中，使所有的核反应、远程雷达和无线电都被干扰而不能运作，进而导致地球大部分地区没有电力和通信，并使得机动兵器需要依赖可充电电池来驱动。
P.L.A.N.T.是一个技术强国，尽管人口非常少，但是开发了许多新技术使得能够与地球方面相匹敌。而对机动兵器的开发使得他们在战争开始时占尽优势。
故事开始于中立的欧普联合所拥有的太空殖民地赫立奥波利斯，秘密开发了5台先进的机动战士，用于投入地球联合的部队，以换取他们的技术数据与中立的欧普联合军队进行共享。此外，赫立奥波利斯还为地球联合军建造了一艘独特的航母战列舰——“大天使”号作为5台机动战士的母舰。该殖民地遭到调整者军队扎夫特部队的攻击，其目的是窃取新型的机动战士。在扎夫特军入侵期间，一名欧普联合的学生，同时也是调整者的基拉·大和在看到朋友处于危险之中时，驾驶GAT-X05“突击高达”以抵挡入侵者，但在随后的战斗中，殖民地遭到严重破坏。随着赫立奥波利斯的解体，幸存者们登上了“大天使”号，开始了他们前往阿拉斯加地球联合基地的旅程。在前往阿拉斯加的旅程中，基拉驾驶突击高达击退了一系列来自扎夫特军的袭击，但在与他童年好友阿斯兰·萨拉的一次战斗中，双方差一点都被对方击杀。基拉在袭击中幸存下来，并由一名盲人牧师带到一个P.L.A.N.T.太空殖民地，在调整者家中修养。在此期间，大天使号抵达了阿拉斯加，但是扎夫特军对那里发起了全面攻击，压倒性的击退了地球联合部队。
在地球联合即将溃败的时候，基拉驾驶ZGMF-X10A“自由高达”前往阿拉斯加，这是一台搭载有高度先进的核动力和反中子干扰器的扎夫特机动战士，由P.L.A.N.T.最高评议会主席西盖尔·克莱因的调整者女儿、P.L.A.N.T.流行歌星拉克丝·克莱因授意偷走。利用自由高达，基拉结束了扎夫特和地球联合两军之间的战斗，但阿拉斯加基地随后还是被摧毁了。大天使号最终逃亡了中立国欧普联合。最终大天使号和新造舰“草薙”号离开地球进入太空，之后他们与拉克丝·克莱因领导的P.L.A.N.T.反对派和他们窃取的扎夫特军新造战舰“永恒”号（原本用于支援扎夫特军造机动战士用）汇合，共同组成“三舰同盟”以结束自然人与调整者之间战争的共同目标。在冲突中，阿斯兰得知基拉幸存下来并依照命令追捕他以夺回自由高达，与此同时获得了同样强大的原型机动战士ZGMF-X09A“正义高达”。然而，在得知作为P.L.A.N.T.最高评议会激进派领导人的父亲帕特里克·萨拉计划实施种族灭绝之后，阿斯兰抛弃了他的父亲并加入了“三舰同盟”。在最终战斗中，地球联合部队部署了装备有中子干扰器对消技术的核武器，该技术是从自由高达和正义高达动力系统的被盗数据中复制而来的。地球联合部队打算用核武器摧毁P.L.A.N.T.太空殖民地，但被扎夫特的创世纪阻止，这是一种搭载有微波激光器的超级武器，旨在对自然界进行种族灭绝。在三舰同盟的干预下创世纪最终被击毁并结束了战斗。随着和平条约的签署，战争最终结束。
故事讲述封印著中国三国时代人物的勾玉辗转流落到日本，并散落在高中学生手上;持有勾玉的人被称为“斗士”，他们会继承勾玉人物，为统一天下而战斗。人物被冠以日本化的汉名(表示方式为“姓名+字”)，校名使用古中国地名，主角为17岁的女高中生孙策伯符。在漫画十九集赤壁之战结束后，作品世界观开始不单局限三国人物，也开始出现一些日本战国时代的新角色。
动画版剧情简介如下：
第1季《一骑当千》：第1季
故事讲述孙策伯符首次登场，转学到南阳高中引起许多风波，并与乐就、吕蒙子明等斗士交手的过程开始激发了体内潜龙的霸王资质。而此时，洛阳高中首领董卓仲颖为了分画各学校的反抗势力，策办了大斗士大会的展开。
许多高校各自派出好手相互对战，但大斗士大会台面下却是暗潮汹涌，正有人为了扭转自身的宿命而开始策画连串的缜密布局...
第2季《一骑当千 Dragon Destiny》：DD
故事转以成都学园为中心。吕蒙子明与夏侯渊妙才潜入中国为争夺宝物龙玉而引发了南阳、成都与许昌三种势力间的争战。但成都学园首领刘备玄德却喜好读书不爱战斗，让身为重要伙伴的关羽云长及张飞益德大伤脑筋。
许昌学园首领曹操孟德勾玉中的魔王领魂逐渐苏醒并开始吞噬他的理智，性格因此变的狂暴嗜血，这点被企图一统天下的司马懿仲达利用，而展开对其他学园的征伐。而身为南阳学园新任首领的孙策伯符，日子仍旧过的悠哉无拘无束，还不知情三国史上著名的赤壁之战，在时隔1800年后又要再度引发...
第3季《一骑当千 Great Guardians》：GG
从这部动画开始，故事走向以原创故事为主。赤壁战后，南阳学园与成都学园结为友好，但左慈元放(王允子师)不知为何开始闪避著吕蒙子明，而在一天夜晚，在吕蒙子明以前出现的，却是本来应该早已死去的情敌，同时也是最强斗士的吕布奉先?
而这时，一名自称是孙策伯符妹妹的神秘美少女孙权仲谋却突然现身，孙策虽然对孙权的来历感到一头雾水，却仍把她当成亲妹妹般疼爱。然而，让王允子师突然变的行踪诡异的原因也开始揭晓，因为，真正的左慈元放竟然出现了...
第4季《一骑当千 XTREME XECUTOR(读音Extreme Executor)》：XX
许昌学园一天突然来了个斗士前来踢馆，而那名斗士自称是凉州学园的马超孟起，是为了替被曹操孟德害死的表兄韩遂文约复仇而来。马超的踢馆引起了许昌一阵轩然大波，虽然靠着许褚的努力才将马超逼退，但心灰意冷的马超竟因偶然加入了成都学园，并拜孙策为师?
这时，一名戴着面具，自称是献帝的神秘人物接触了南蛮学园的孟获与孟优姐妹，并搧动她们再度召开大斗士大会，她的目的究竟是...?
第五期OVA《一骑当千 集锷斗士血风录》：血风录
南阳、成都与许昌三所学园展开了校外旅行，目标是在关西地区进行战斗竞赛，打倒敌人抢夺对方的锷，并沿途享受各路的风景名胜。只是，在旅行最后，孙策却与关羽展开了激烈冲突...
第六期OVA《一骑当千 Extravaganza Epoch》：EE
故事走向转回漫画原作的战国篇。由持有古代战国武将转世勾玉，来自关西地区的全新角色为中心，开始进行关东地区三国斗士的勾玉掠夺战。不单传出关羽被人袭击而被揍的面目全非，清龙刀毁的流言，赵云也在竹林遇到持有妖刀一片石的神秘少女斗士柳生三岩。
源九郎义经与武藏坊弁庆的组合将许昌学园杀的狼狈不堪，就连成都学园也被宝藏院胤舜袭击的满目疮痍。而让关西斗士如此行动的幕后主谋卑弥呼，也将她的手伸向了还不知情的孙策...
第七期电视短编(全三集)‘一骑当千Western Wolves’：WW
关东关西斗士正式开战，而孙策和真正的妹妹孙权重逢。
故事大纲
在游戏版本中，随着选择的不同，后面剧情亦会出现极大改变。游戏共有3条主线故事：“Fate”、“Unlimited Blade Works”及“Heaven's Feel”。玩家必须依次完成篇章才可解锁下一个线路。
序章
传说，在日本的某个名叫“冬木市”的城市里，每隔数十年，会出现能实现其持有者所有愿望的宝物“圣杯”。7名魔术师(御主(マスター，Master))与7名使魔(从者(サーヴァント，Servant))签订契约，为了争夺圣杯而参与“圣杯战争”。能获得圣杯的只有一组，这7组人马各自为了成为最后的那一组而互相残杀。但是，这场战斗和魔术是完全对公众隐藏的。
高中二年级的冬天，远坂凛继承了在上次圣杯战争中丧生的父亲的遗愿，参与圣杯战争。凛召唤了一名男性从者，但是由于他对年轻的魔术师凛采取了轻视的态度。为了使他按自己的意愿行事，凛使用了次数有限的绝对命令权：令咒。虽然由于命令抽象而效果甚微，但出于作用于他的强大魔力，这名从者承认凛是他的御主，自己是Archer(弓兵)的从者。
第二天，凛注意到学校里被设立了一个以危害校园内的人员而获得魔力为目的的结界，于是在学生不在的夜间开始调查，期间遭到了别的从者Lancer(枪兵)的攻击，Archer便与之战斗。但是，一名学生目击到了这场战斗，Lancer为了封口而杀害了那个学生。那位学生名叫卫宫士郎，因为有重要的缘分，远坂凛用父亲留下的吊坠中的魔力救下了他，但是注意到Lancer不会放过死而复生的目击者后，为了保护士郎和Archer一起赶往了士郎的家(卫宫邸)，却在卫宫邸前被新的从者袭击。那个从者是一个身材矮小的金发少女，是凛真正希望召唤的从者：Saber(剑士)。
卫宫士郎是10年前(1994年)发生的冬木市火灾的幸存者，曾由其养父教学了基本的魔术，是一名半吊子魔术师。2004年2月2日晚，士郎在夜晚的学校偶然目击了从者Archer和Lancer之间的战斗，被Lancer杀死后幸得远坂凛用父亲留下的吊坠中的魔力所救，随后回到了家。而他没死的事很快被Lancer知道，刚到家不久就被Lancer追杀。他逃到了院子里的仓库里，发现藏在地上的魔法阵发动了，无意中召唤了从者之一的Saber(剑士)，被卷入了圣杯战争。士郎希望继承在灾难中救了自己的亡父卫宫切嗣的理想，成为“正义的伙伴”。士郎同意以御主的身份参与战争，以防止其他御主造成进一步的灾难，导致十年前的悲剧再度重演。
故事结局
原著游戏中，故事结局共有45个。其中Bad ending/Dead ending出现了四十次，不过于其中一个结局中，士郎虽然死亡，此结局仅被归类于Normal End;最后五个以胜利者身份完成第五次圣杯战争的正面结局(并非所有Bad Ending士郎皆无法胜利，只是就剧情来说是属于负面结局)。而五个胜利的结局分别为：
Fate(Saber路线)
唯一结局：梦的延续
完成圣杯战争，完成与士郎的约定，破坏圣杯后，Saber终于可以放下从者的身份，微笑着对士郎说出“我爱你”。得到解脱的王回到自己的时代，归还精灵之剑，带着王的骄傲，在树下平静地安息，2006年Studio Deen制作的Fate线电视动画即以此作为结局之基础。
Unlimited Blade Works(凛路线)
True End：Brilliant Years
与士郎和Archer的相遇，使Saber坚定了自己的信念。带着对士郎的情感，Saber和Fate路线一样，继续走完她的旅途。Archer在朝阳下离去，将过去的自己托付给凛。士郎与凛经过残酷的战争后，士郎跟随凛学习魔术并定下相守一生的约定，在此结局中有透露凛即将在毕业后前往英国伦敦塔进修，并且邀约士郎一起前往伦敦，2010年制作的Unlimited Blade Works线剧场版和2014年重制的Unlimited Blade Works线电视动画即以此作为结局之基础。
Good End：Sunny Day
即使经过两次圣杯战争的血战，Saber仍未明定自己的意念，因此Saber决定借助凛与士郎的魔力，以“使魔”这种不会涉及到圣杯规定的契约留于现世。与士郎、凛过着幸福的三人生活的同时也试着寻找自己的信念。2015年ufotable公开了以此为结局的UBW动画SP。
Heaven's Feel(樱路线)
至少完成[Saber]、[凛]路线其一之结局之后才可解锁的游戏路线，所有的伏笔、真相皆于此路线中揭明，透过此路线的进程，玩家可完整的了解所谓圣杯战争真正的“样貌”。
True End：春天归来
伊莉雅丝菲尔以生命为代价留住士郎的魂魄，凛借助一个人偶使士郎复活。之后具有圣杯机能而拥有接近无限的魔力的樱以补充魔力的方式保持士郎的生命力。凛从伦敦返回后，似乎也加入进来。
在老虎道场第39回表示此线为游戏真正的结局。(奈须磨菇在后来已否定此线为真正结局。TYPE-MOON的世界是平行宇宙，即每个故事版本都可被视作“真正”发生。)
Normal End：樱之梦
士郎做出最后的投影以破坏几乎成型的圣杯，自身完全崩溃。得到救赎的樱在卫宫邸住下，一直期待与之相会，直到生命尽头。
“Réalta Nua”版追加结局
Last Episode(最后的结局)
Réalta Nua为爱尔兰语，意为新生。在2007年于PlayStation 2发售的《Réalta Nua》版本中，另追加Fate线的后续补完结局：“Last Episode”(最后的结局)。该剧情在完成全部45个结局后出现。
Saber在Fate线中完成她身为王的理想，来到理想乡。之后士郎与Saber在理想乡中再次相会。据Last Episode最后的解释，该草原即是阿瓦隆。