上条当麻是学园都市的一名高中生。在这座位于东京都西部的封闭都市中，学生占到了总人口的八成，“超能力开发”被列为绝大多数学生的必修课，在Level 0到Level 5的等级排名上相互竞争。不幸地，上条当麻被评定为无能力者；但他的右手有着能将一切异能消除的不明力量，他本人称其为“幻想杀手”。似乎是连同神的祝福一同抹杀的关系，他每天都过着不幸的生活。

暑假的一天，在宿舍的阳台上，上条当麻遇见了一位挂在阳台栏杆上的修女。她自称“禁书目录Index”，脑海中装有十万三千册“魔道书”，正在从不为人所知的“魔法”世界逃亡。就这样，上条一脚踏进了魔法与科学的纷争。

本作的世界观以现实世界为蓝本，但并未说明详细历史时期，大致可以推测故事发生在虚构的近未来[d]。其历史与现实世界有共通点（如前两次世界大战、冷战等；亚雷斯塔更是现实中存在的人物），但也有显著的差异。

学园都市是科学势力的大本营，同时也是本作的主要舞台。位于日本东京西部，居住着230万人口，其中八成人口是学生，而这些学生大都是超能力开发的实验对象。学园都市具有领先世界20-30年的科技实力，掌握着多种近未来高科技兵器，并公开地培养超能力者；事实上是由统括理事会所主导的、严格封闭的国中之国。

而魔法势力则较为分散，主要由名目繁多的宗教组织和魔法结社构成，也有不属于任何组织的魔法师存在。教会势力中，十字教有三大主要教派：英国清教、罗马正教和俄罗斯正教（分别以英国圣公会、天主教和东正教为原型）；而魔法结社则包括以黄金黎明为源头的黄金系结社、依靠北欧神话理论的“捣蛋鬼”，阿兹特克系的“有翼者的归来”等。魔法势力之间常会出于各自不同的目的互相斗争，魔法师出于个人信念私自行动的现象也广泛存在。

在魔法势力与科学势力之外，尚有两不从属的一般组织与国家，如美国；作品中也出现了许多虚构的政权，除学园都市外，还有“伊莉沙里纳独立国同盟”、“巴格吉城”等。

本作中，除“现实世界”之外，尚存在更高等级的、无法以一般手段探知的其他次元的“位相”；神、魔神、天使、妖精、无法以语言名状的高等级存在[e]，也均在作品中有所提及。

作品是以意大利实际存在的学者“伽利略·伽利莱”子孙的三姊妹为主角，所展开的战斗动作冒险故事。标题设计特意加入了“Storia di tre sorelle a caccia di un mistero”这段意大利文。并由梅津泰臣负责原案、监督一职，是其继《危险代理人》后睽违9年的作品。 其“Donna”为意大利语，意指少女、少妇。

2006年开始计划此作品时，标题原本有将“伽利略少女”（ガリレァ‖ール）列入考虑，但怕跟东野圭吾的伽利略系列作品混淆，最终决定使用此名。

西历2061年，全球进入了冰河期初期。居住在意大利托斯卡尼的法拉利三姊妹，有一天被神秘组织袭击，并突然成为了国际通缉犯，三姊妹因此过着逃跑并探索伽利略宝藏之谜的生活。

故事发生在遥远的2061年，自然的破坏使得地球的环境变得十分恶劣，气温骤降大地冰封，在意大利图斯卡纳，居住着伽利略的后代三姐妹。叶月（真堂圭 配音）个性奔放耿直，大大咧咧的她心怀着成为检察官的梦想。神月（大久保瑠美 配音）个性冷淡沉默寡言，拥有极强运动神经的她其实在内心里十分的需要保护。星月（日高里菜 配音）是个高智商少女，对机械颇为精通，三姐妹中要数她的性格最为温柔可人。

一次偶然中，三姐妹遭到了陌生人的突然袭击，而袭击者的目标只有一个，那就是得到传说中的“伽利略的遗产”，可是，对于这笔遗产的存在，三姐妹一无所知。为了不让宝贵的遗产落入坏人手中，本性个性迥异而不合的三姐妹决定合作。

每集列表

故事发生在面积占据东京都的三分之一，居住着230万名人口且其中八成人口是学生的巨大都市“学园都市”。学园都市的学生均会接受超能力开发，借由药物、催眠术与通电刺激等方式取得超能力。能力者以范围和威力分为无能力者Level 0至超能力者Level 5。

主角御坂美琴是学园都市中仅七位超能力者Level 5的其中一人，排行第三。她是拥有操纵电击能力的“电击使”，因其特有的绝招(将硬币以音速的3倍的初始速度发射)“超电磁炮Railgun”而得名。

本作通过美琴的视角来描绘学园都市的平常而不平凡的日常生活，也叙述学园都市秘密进行非人道性质的实验，从而使大家对于本作及本篇《魔法禁书目录》的背景(世界观中科学侧)的认识慢慢变得清楚。