故事舞台为苇原町的“创圣学院(創聖学院)”，学院分为两个学部，一为明治时代以来的女校“创圣女学院”学部，俗称“完美(フローレス)”(来是由钻石的净度级别FL(Flawless)，指无瑕，是最高级的净度);二为近年创立的男女校“创圣一般学部”，俗称“细微(スライトリー)”(同是来自钻石的净度级别，指微瑕疵的SI1和SI2(Slightly Included)，比FL低数级)。前者是校风严肃的传统名门学校，后者是自由度高、理念革新的学校，两者几乎相反。而男主角泉户裕理则是属于一般学部，并且是八衢神社宫司泉户裕导的儿子，并有几乎如亲妹妹一样的小鸟游由美奈。
裕理与友人河合亚芽里和要三九郎一起度过升上三年级前的春假，当时学院正进行操场的扩充工程，其间发掘到刻有奇异文字的遗迹，其文字就是裕理家中神社所奉祀的神祇“太转依(太転依(たゆたい))”。但学院鉴定遗迹并无价值而继续工程。数日后开学仪式的当日，裕理被女学院学部如月美冬质疑是阻止扩充工程的人，裕理虽自身知道无关系，但不能辩驳而逃走。裕理认为破坏遗迹恐怕会有灾难发生，遂于深夜潜入学院，进行转换神祇灵魂的仪式，名为“绮久罗美守毘卖(綺久羅美守毘売(きくらみかみのひめ))”、看上去如神一般的纯白灵体立刻出现，并述说约五百年前人类与太转依的共存问题，最后“化成”另一位有狐狸耳和尾的小女孩。之后裕理替其取名为“真白(ましろ)”。
“真白(ましろ)”需要通过睡眠才能回复力量，于是来到八衢神社。
东京篇
主角绯村剑心流浪至东京，因为神谷薰的挽留而留在东京。其后认识了明神弥彦、相乐左之助及高荷惠等人，又与前幕府杀手鹈堂刃卫、御庭番众首领四乃森苍紫决斗，其间剑心经历了多次战斗，令剑心自觉慢慢变回昔日的刽子手拔刀斋(千人斩拔刀斋)(人斩り抜刀斎)。最后在与幕末时代的对手前新撰组第三小队组长斋藤一决战及得知志志雄一党的阴谋后，独自前往京都与志志雄一党对决。(漫画、电视动画)
京都篇
前维新志士志志雄真实及他的同党正在秘密活动，目的是推翻明治政府，由他带领日本成为强国。剑心为了阻止志志雄的计划得逞，独自离开东京前往京都。后来剑心的同伴亦逐一赶到京都寻找剑心，剑心从师傅比古清十郎身上学会飞天御剑流的最终奥义“天翔龙闪”后，与其同伴相乐左之助及斋藤一、四乃森苍紫联手，终于打败了志志雄一党。(漫画、电视动画)
漫画及电视动画的东京篇及京都篇在故事上大致相同。在京都篇完结后，由于当时漫画只是刚开始连载人诛篇，跟不上电视动画的制作进度，因此电视动画另行制作了岛原篇、胜海舟篇、由太郎篇(黑骑士团篇)及风水篇。但受到原作版本的读者批评与原作版浪客剑心的世界观相异，因此后期收视不太理想，在风水篇后便终止制作。
追忆篇
故事发生于剑心在幕末身为长州派维新志士时担当刽子手的年代(东京篇之前的故事)。故事讲述剑心与第一任妻子雪代巴的过去，解明了剑心左边面颊的十字疤之谜。OVA故事共分四幕，第四幕尾段雪代巴为阻挡敌人向剑心发出最后一撃的同时，亦被剑心一剑杀死，临死前用自杀的小刀在剑心面上划上一刀，与未婚夫清里和剑心死斗时划下的一刀，交织成剑心脸上的十字疤。漫画版的追忆篇连载于人诛篇初期剑心的回忆自述，而OVA则独立讲述剑心的过去。(漫画、OVA)
OVA版本的追忆篇内容虽然与漫画原著并无太大出入，但其风格却与之前的电视动画版大大不同。彻底摆脱了少年漫画的风格，特别是拔刀斋出招时其没有像过往一般大喊出必杀技名称，而一般很难于少年漫画及电视动画中出现的大量血花四溅的残酷场面亦一一呈现。坊间对此等手法毁誉参半，例如其血腥露骨的场面可能不适合原作的主要读者(小学生、中学生)，但亦得到一般未看过原作的人支持。而本作于日本海外评价亦相当高，在美国的销售亦曾登上全年DVD销售榜的第7位。
人诛篇
雪代巴之弟雪代缘当年亲眼看到姐姐死于剑心的刀下，长大后集合了“六人同志”，向剑心展开复仇行动(在上海流浪垂死之际被好心日本家庭收留，却因为只想练能攻克剑心武功的念头而杀死对方一家并取走武功秘笈单刀法而自练出倭刀术以及其绝招虎伏绝刀势)。由于雪代缘的阴谋，使剑心一度以为神谷薰被杀而意志消沈(神谷薰之死令当时少年JUMP周刊的读者引起一阵回响)。最后剑心回复斗志并打败雪代缘，雪代缘持着其姊的日记消失在剑心等人面前。(漫画)
番外篇
结束连载以后以SP模式连载两个番外篇，分别是《早春樱花》及《弥彦的逆刃刀》。前者提到了结局之后众人各自的新旅程，如左之助的世界一圈之旅到了蒙古。后者是弥彦以神谷活心流行侠仗义的活跃篇。
第零幕
2012年初由日本漫画杂志“JUMP SQ”公开了《浪客剑心》将于八月号开始推出新连载《第零幕》，与1999年结束的连载相隔十三年的新篇章。
北海道篇
2017年9月连载的新续篇，故事发生在“人诛篇”后5年(1885年)，绯村剑心和神谷薰动身前往北海道寻找薰的父亲神谷越路郎，同时和环游世界回来的左之助、在日本流浪的宗次郎、在北海道服刑的安慈、与调往北海道的斋藤一重逢。就连新撰组的永仓新八，也将在“北海道篇”出现。
“狩龙人”是一项挥舞银剑，狩猎恶龙，获取报酬的职业。
狩龙人少年拉格纳，与拥有惊人的龙讨伐数的天才少女蕾欧妮卡组成搭档，开始了日复一日讨伐龙的挑战。他的愿望只有一个——“不变强也没关系，我只想一直待在蕾欧身边。”少年的愿望因最凶恶之龙的袭击而随之破灭。
挑战绝对的强者，反抗强制的命运，向着极限前进——
超克己主义异世界极限战斗!!