舞台设置
故事舞台位于虚构的见泷原（日语：見滝原／みたきはら Mitakihara）市。城中充斥着可能实现的新科技，因此剧中的现代世界充满未来感，许多建筑物以迪拜、美国、欧洲与日本群马县的真实建筑为范本。在设置中，见泷原是近几年新开发的地方都市，新兴住宅区毗邻人工的景观绿地以及小溪，郊外则有风力发电设施、水门以及工厂等。见泷原作为行政区，有时被称为“市”，有时则又是“町”，官方资料并未统一。
剧中世界设置了魔法少女与魔女的存在，但不为一般人知晓。然而，早在史前时代全世界就有许多魔法少女了，历史借由她们的暗中活跃而被推动，包括克丽奥佩脱拉七世、卑弥呼、圣女贞德等史实人物都在其中。此外，被魔女盯上的人，则会原因不明地自杀或杀人。
本作故事围绕着鹿目圆、晓美焰、美树沙耶香、巴麻美、佐仓杏子5名魔法少女以及外星生物丘比（QB）依次展开。
本作所谓的魔法少女，是以“可以实现任何一个愿望”的代价与QB交换契约后，背负着“讨伐魔女”此一使命的存在。象征魔法少女资质的魔法系数，则取决于该名少女拥有的因果量，资质较高者通常是一国之主、被称为救世主的人物。然而，主角小圆虽然只是平凡的中学生，却拥有神明等级的高资质。
魔法少女缔约时，会同时生成名为“灵魂宝石”的物品。灵魂宝石是魔法力量的泉源，可以感知魔女存在的位置，也有发动变身的功能。基本外型都是鸡蛋状，但平常也化为戒指状，变身后依各人状况，变化为外型相异的饰品，镶嵌于身上某个地方。
魔女是一种奇形怪状的异物，通常伴随一般人看不见的异世界“结界”以及部下“使魔”出现。魔女身上携有名为“悲叹之种”的黑色宝石，这是魔法少女消灭魔女的直接酬劳。
使用魔法会使灵魂宝石逐渐混浊失去光辉，即使完全不使用魔法，维持一般身体活动仍会一点一滴累积混浊。悲叹之种可以转移灵魂宝石的混浊，以便魔法少女可以继续活动。因此，魔法少女必须定期消灭魔女，以避免灵魂宝石变得混浊。
在续作《［新篇］叛逆的物语》剧中，首次出现与灵魂宝石不同的“黑暗宝玉”。这是由“fort/da”游戏的粉红线轴与灵魂宝石的碎片、加上人类感情的极致所构筑而成的。黑暗宝玉通常呈夹式耳环状，附着在晓美焰的左耳上，耳环中的宝石封印了小圆的力量。
情节展开
出身于良好家庭，亲朋好友团聚，有哭有笑，是谁都拥有的日常生活。就读市立见泷原中学2年级的少女鹿目圆，如此平凡地过着幸福的每一天。直至一名神秘转学生晓美焰的出现，让小圆的命运开始改变。
当天，小圆与好友美树沙耶香在返家途中，撞见一只伤痕累累，被焰所猎杀的不明生物丘比（QB）。风波过后，QB希望少女们和自己交换契约，成为“魔法少女”讨伐人类之敌。然而此后，随着残酷真相渐遭揭露，小圆的想法也一再受到冲击……
西国一流间谍“黄昏”奉命调查东国政治家多诺万·德斯蒙之政治阴谋。然而，德斯蒙深居简出，唯一公开露面的场合只有他儿子所就读的东国名校——伊甸学园举办的恳亲会，故只有让“自己的小孩”进入伊甸学园就读，并以家长的身份参加恳亲会，才有机会与其接触。为顺利执行任务，黄昏以“劳埃德·福杰”的身份掩人耳目，并先后找到“女儿”阿尼亚和“妻子”约尔组建一个临时家庭，殊不知阿尼亚其实是有读心能力的超能力者“实验体007”;而看似温柔善良的妻子，另一身份是职业杀手“荆棘公主”。三人互相隐瞒真实身份，就此过起虚假的家庭生活。
樱田纯是一名不愿上学而长期足不出户的中学二年生。他热衷于网上购物，喜欢在购买物件后的退货限期内退回，只是房间里还是放有许多奇奇怪怪的诅咒物品。有一天，他收到一张传单，上面只写了一句“上发条 不上发条”的选项。在好奇心驱使下，纯选择了“上发条”，之后房间就出现了一个神秘的皮箱，里面装着一个非常美丽、质感近似真人的人偶。使用附带发条转动背部的开关后，人偶像有生命般活动起来，向纯说：“我的名字是真红，蔷薇少女的第五人偶。”伴随这次相遇而来的，是更多相似的人偶，与及身份神秘的旁观者。他们一同为着某个失踪良久的认同而努力，展开一场潜越世界和时间所限的游戏……
蔷薇少女(ローゼンメイデン，Rozen Maiden)
是传说中拥有生命的不可思议人偶，制作者是神秘的人偶师罗真(ローゼン)。制作非常细腻，酷似真人，但从未在市面上流通过。
蔷薇少女就如同虚幻的存在，选择她们，她们便存在于“世界”，否定她们，她们一开始便不存在于这世上，就像是被邀请的客人一般。
媒介(ミーディアム，Medium)
与蔷薇少女订下契约的人类。成为媒介者会提供自己的能量给予蔷薇少女活动的力量，不论有无媒介的情况下，蔷薇少女皆能在现实世界中使用特殊能力，但有媒介时，能力会增强。
蔷薇戒指(薔薇の指輪，Rose Fingering)
媒介与蔷薇少女之间契约的证明，在契约取消前不会消失也无法取下。在原作漫画中缔结契约的方式是契约者由蔷薇少女取得戒指，戴上后亲吻戒指表示契约形成，而动画版则是契约者必须亲吻在蔷薇少女手上的戒指，表示契约形成，此时会在自己手指上形成戒指。若同时与两名以上的蔷薇少女缔结契约，戒指会合为一体，体积也会变大。人偶过度使用力量导致媒介的力量用尽时，媒介会被戒指吞噬，最后与人偶合为一体(动画中，如果媒介的力量用尽，媒介就会死)。解除契约时，戒指会破碎消失，同时人偶也无法再使用媒介的力量。若在战斗中解除，就代表人偶在爱丽丝游戏中失败，失去成为爱丽丝的资格(动画中，解除契约的方式是由人偶亲吻媒介手上的戒指)。
爱丽丝(アリス，Alice)
存在于罗真(父亲大人)心中的女孩。比任何花都要高尚，比任何宝石都要无暇。唯一纯洁无瑕而且象征完美的少女。成为爱丽丝，是蔷薇少女们的宿命。
爱丽丝游戏(アリスゲーム，Alice Game)
蔷薇少女的宿命，必须互相战斗夺取彼此的蔷薇圣母。相信最终获胜取得全部蔷薇圣母的人偶，可成为爱丽丝;事实上，不用经过爱丽丝游戏，也能成为爱丽丝。
蔷薇圣母(ローザミスティカ，Rosa Mystica)
蔷薇少女生命的来源，也有一说是类似人造人的生命源贤者之石;失去蔷薇圣母的蔷薇少女就会成为一般的人偶，精神将成为游魂。而获得别人的蔷薇圣母的人偶，可以增强自己的力量。以及使用被夺走蔷薇少女的一切(人工精灵、武器、能力、记忆)。
除此之外，剩下蔷薇圣母的人偶只能透过感应与其他人偶对话。接收蔷薇圣母可能会有些许副作用，像是排斥反应。
N领域(Nのフィールド，N-field)
虚与实，正与负，什么都存在也什么都不存在的世界。人偶们可以以类似镜子的物质(镜子、玻璃、水面)当作进出N领域的门。而每个人偶也都拥有属于自己的N领域，在自己的领域之中战斗会比较有利。人偶在没有媒介在身旁的情形下，只能在对方的N领域中停留30分钟，若超过时限，战斗能力将会大幅减弱。
世界树(Yggdrasil)
存在于梦世界的巨树，连接着所有人类的心之树。参照→世界树
潜意识之海(無意識の海)
存在于N领域中的特殊区域，夹杂现在过去未来的时间洪流，包含所有一切思绪与记忆之海，若走在浅滩上则会看到许多幻觉。
潜意识之海也是第七人偶雪华绮晶N领域的境界地带，连接梦境与N领域，这也代表了雪华绮晶的N领域除了镜子外，梦境(睡眠)也是一道入口。
人工精灵(Artificial Spirit)
蔷薇少女所使役的助手。拥有不可思议力量的精灵，每个蔷薇少女都有一个，帮助蔷薇少女寻找媒介，战斗时也是蔷薇少女不可或缺的帮手。蔷薇水晶并不是没有人工精灵，只是其出现时间不长，因此并没有提到名称。
皮箱(鞄，Briefcase)
蔷薇少女沉睡时所放置的箱子，镶著蔷薇的标志，蔷薇少女平时也必须在皮箱内睡觉才能获得真正的休息。也可将皮箱当作飞行交通工具。
父亲大人(お父様，Father)
制作出蔷薇少女系列的人偶师，罗真(ローゼン)。